产品货号：
GS0155
中文名称：
通用型PCR扩增试剂盒
英文名称：
SgPfu PCR Kit(without Loading Dye)
产品规格：
50次|100次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒可用于普通PCR、RT-PCR、RAPD、PCR测序、RACE、DD-PCR以及其它PCR相关的实验室工作。
影响PCR反应的因素很多，即使使用经高度优化的PCRMaster也会遇到问题。如果发现PCR反应没有得所需产物或条带较弱，建议用25mM MgCl2调节反应体系中的Mg2+浓度，以期获得更好的结果。
| 组分 | 50次 | 100次 |
| Pfu DNA Polymerase(5U/μL) | 25μL | 50μL |
| 10×PCR Buffer | 300μL | 600μL |
| dNTP Mix(2mM) | 300μL | 600μL |
| Sterilized ddH2O | 2mL | 4mL |
保存：-20℃
- PCR能够从很少量的分子开始获得超过1千万拷贝数的目标DNA序列。其敏感性要求模板不能被实验室环境中其他DNA或以前的扩增产物所污染。
- DNA模板的准备，反应混合物的调配，PCR反应过程以及随后的产物分析都应在不同的地方分开操作。
- 建议使用带有紫外灯的超净台来混合反应混合物。每一步PCR操作都应该使用新的手套。
- 要求PCR反应所需试剂分开配制并且只用于此目的。
- 溶液应分装成小计量单位并保存在指定存放PCR试剂的地方。试剂应该与其他DNA模板分开存放。
- 为了确定无污染，应该同时做一个不含DNA模板的标准反应。
- 模板DNA准备：基因组DNA，反应体系中模板浓度推荐范围1～10μg/mL；质粒或噬菌体DNA浓度0.1～1ng/mL。
- 在无菌洁净的PCR管中，参考下面体系配制反应溶液。
成分 终浓度 用量 Sterilized ddH2O - 补足至50μL 10×PCR Buffer 1× 5μL dNTP Mix 0.2mM 5μL Primer 1 0.1～1μM x μL Primer 2 0.1～1μM x μL Pfu DNA Polymerase 1U x μL 模板DNA 10pg～1μg x μL - 轻轻混匀后短暂离心。
- 在同时进行几个平行反应时，将原本单独分装在各个离心管中的反应物，在一个离心管中混合均匀再分装到各PCR管中，再依次加入MgCl2和模板DNA，可大大减少错误率，并节约了大量试剂转移所需的时间。
- 加适量的矿物油后，置于PCR仪中进行PCR反应。
- 对于有热盖的PCR仪可不加矿物油。
| 模板DNA | 50μL体系中，通常质粒或噬菌体DNA模板加入量为0.01～1ng，基因组DNA模板加入量为0.05～0.5μg。过高的模板量会增加非特异性PCR产物含量。如果对合成的保真度要求高，模板DNA增加量要与所需扩增产物的增加成比例。许多方法都可用来纯化模板DNA，但在纯化DNA模板中，即使微量的试剂（如苯酚、EDTA、蛋白酶k等）都会强烈抑制Pfu酶活性。使用乙醇沉淀并且反复使用70%的乙醇洗涤处理，可有效地去除模板DNA中所含的微量污染物。 |
| 引物 | 通常PCR引物的长度为18～25个碱基。GC含量应在40～60%之间，C和G在整个引物中应均匀分布。应避免在引物的3'末端超过3个C或G，否则会增加非特异性引物。 在反应混合物中应该防止引物的自连以及与其他的引物相连，这样可以避免引物二聚体和发夹环结构的形成。 |
| MgCl2 浓度 | 实验中，应选择最佳的MgCl2浓度。Mg2+浓度不足会降低PCR产物产量，而反之则可能增加非特异性产物量，降低合成的准确性。在标准反应中，MgCl2推荐浓度在1～4mM。根据经验，dNTP的终浓度为0.2mM时，则MgCl2的最适浓度应该在1.25～1.75mM。若模板DNA中包含有EDTA或其他螯合剂时，应适当增加MgCl2浓度。 |
| dNTP | 通常每个反应混合物中单个dNTP的浓度应该在200μM。dNTP终浓度在10～50μM时，DNA可以准确合成，在此浓度范围内，PCR产物可获得高保真性。而MgCl2的浓度应从1mM起，以0.1mM的梯度递增，直到获得最适浓度。 |
| Pfu酶 | 通常在100μL反应混合物中加入2～3U的Pfu酶，过高的Pfu酶浓度会导致合成非特异性产物。若反应混合物中存在含有抑制剂（如使用了未经完全纯化的模板DNA），为了获得高产的扩增产物，可增加Pfu酶的含量（4～5U）。 |
| 预变性 | PCR反应初始阶段，DNA模板完全变性非常关键。不完全变性可能导致第一次扩增循环中模板的使用效率低，PCR产物产量少。如果GC含量等于50%或更低时，推荐95℃预变性1～3分钟。若富含GC的模板，间隔时间应延长至10分钟。若95℃下预变性时间小于3分钟，则可将Pfu酶加入到初始反应混合物中。若必须增加预变性时间或是提高预变性温度，应在预变性之后加入Pfu酶（Pfu酶在超过95℃的条件下会大大降低稳定性）。 |
| 变性 | 一般来说，在第一次扩增循环中所合成的PCR产物要明显短于模板DNA，且在该条件下可被完全变性，所以94～95℃变性1～2分钟足矣。若扩增DNA的GC含量很高，则应延长变性时间至3～4分钟。也可利用附加物使DNA变性，如甘油（最高可达10-15的体积百分比），DMSO (最高达10%)或甲酰胺(最高至5%)。但附加物存在会明显降低引物-模板DNA复合物的溶解温度，所以应该根据经验来选择合适的退火温度。使用附加物，需要适当的增加Pfu酶的浓度（DMSO或甲酰胺会抑制大约50%的Pfu酶）。通常在反应混合物中用7-deaza-dGTP来代替dGTP，这样可以降低PCR反应的溶解温度。 |
| 引物退火 | 通常最佳退火温度应该是比引物-模板DNA溶解温度低5℃。若所获得的非特异性产物要高于目的产物，则需要每次增加1～2℃退火温度来优化产物的特异性直至达到最佳退火温度。 |
| 延伸步骤 | 通常在70～75℃进行延伸，当扩增大片段时，每1kb需增加80秒的延伸时间。 |
| 循环次数 | 如果模板DNA的拷贝数小于10，则40个循环就可以。如果初始模板DNA的量更高，那么25～30个循环足矣。 |
| 最终延伸 | 在最后一个循环结束后，样品需要在72℃下浴温5～15分钟来补平新合成的PCR产物的延伸末端。 |
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